胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)基

胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)基，實驗中的胡蘿卜的組織培養(yǎng)實驗成功率比較低，主要體現在污染率較高和出芽率低上，在長期的實驗中，有些胡蘿卜的愈傷組織基本分化不出芽。針對這一問題我們反復實驗。通過把培養(yǎng)出來的胡蘿卜的愈傷組織進行懸浮培養(yǎng)后，再轉接到固體培養(yǎng)基上，從而使得胡蘿卜愈傷組織更容易分化出芽來。并使整個過程控制在無菌條件下，現就胡蘿卜組織培養(yǎng)的整個實驗過程控制作一詳細介紹。

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    實驗中的胡蘿卜的組織培養(yǎng)實驗成功率比較低，主要體現在污染率較高和出芽率低上，在長期的實驗中，有些胡蘿卜的愈傷組織基本分化不出芽。針對這一問題我們反復實驗。通過把培養(yǎng)出來的胡蘿卜的愈傷組織進行懸浮培養(yǎng)后，再轉接到固體培養(yǎng)基上，從而使得胡蘿卜愈傷組織更容易分化出芽來。并使整個過程控制在無菌條件下，現就胡蘿卜組織培養(yǎng)的整個實驗過程控制作一詳細介紹。



    1. 實驗流程

    （1）實驗總流程：

    MS母液培養(yǎng)基的配置→胡蘿卜愈傷組織誘導培養(yǎng)培養(yǎng)基的配制→胡蘿卜愈傷組織誘導→胡蘿卜愈傷組織的繼代培養(yǎng)→觀察記錄

    （2）無菌操作流程：

    實驗員消毒→實驗室、無菌臺滅菌→實驗器材的滅菌→無菌接種→消毒→實驗臺衛(wèi)生 （3）胡蘿卜愈傷組織誘導培養(yǎng)流程：

    胡蘿卜愈傷組織誘導培養(yǎng)基的配置→胡蘿卜愈傷組織誘導培養(yǎng)培養(yǎng)基的分裝→胡蘿卜愈傷組織誘導培養(yǎng)培養(yǎng)基滅菌→取材及材料的消毒滅菌→接種與培養(yǎng)

    （4）胡蘿卜愈傷組織的繼代培養(yǎng)流程：

    器械及實驗者的消毒滅菌→剝離愈傷組織誘導培養(yǎng)所得的愈傷組織→胡蘿卜愈傷組織接種

    2. 實驗儀器及材料

    胡蘿卜（市場購買）、超凈工作臺、光照培養(yǎng)架、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫振蕩器、打孔器、小刀、培養(yǎng)皿、解剖刀、鑷子、植物組培試劑盒。

    3. 胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)基 實驗方法與步驟

    3.1胡蘿卜愈傷組織的誘導

    ①外植體消毒用清水洗干凈胡蘿卜直根，用小刀給其削去表皮，并切成小段放入燒杯中。先用70%酒精對胡蘿卜直根消毒5min，用無菌吸水紙吸干，再用10%的次氯酸鈉溶液消毒10min（或用0.1%的消毒10min,接著用無菌水漂洗一遍，再用無菌水浸泡30min），放入無菌水中漂洗2~3次，用無菌吸水紙吸干待用。

    ②外植體接種。把消毒好的胡蘿卜直根放入無菌培養(yǎng)皿中，用消毒好的小刀沿截面將其橫切成厚度1mm左右的小圓片，然后將小圓片的韌皮部和木質部切去，留下形成層，再將形成層切成大約長5mm、寬5mm、高1mm的小長塊（如圖1a）。為了操作簡便、快速，外植體美觀，建議使用打孔器切取胡蘿卜外植體。具體操作方法： 把消毒好的胡蘿卜直根放于無菌培養(yǎng)皿中（建議使用一次性塑料培養(yǎng)皿），用小刀將其切成2~3cm的小段，用滅過菌的打孔器沿著形成層穿入胡蘿卜中，取得一段含有形成層的2~3cm的圓柱體，然后用無菌解剖刀片將其切成厚1mm的小薄片，將切好的胡蘿卜外植體接種在MS+2mg/L2,4-D+1.5mg/L KT的固體培養(yǎng)基上，放于黑暗處25℃條件下進行暗培養(yǎng)，50d后長出淡黃色愈傷。 3.2胡蘿卜愈傷組織懸浮體系的建立

    用鑷子夾取在固體培養(yǎng)基上繼代20d的胚性愈傷組織即分散性好、疏松的愈傷用解剖刀切碎，接種在MS+0.3mg/L 2，4-D+3%蔗糖的液體培養(yǎng)基（pH5.8）中，每100mL的三角瓶中加入MS液體培養(yǎng)基50mL，搖床轉速為110r/min，溫度為25℃，黑暗培養(yǎng)，每隔7d繼代一次，

    連續(xù)培養(yǎng)4代~5代后逐漸形成穩(wěn)定的細胞系。 3.3懸浮細胞系的繼代

    采用吸取法、靜止法和瓶壁法進行繼代培養(yǎng)。吸取法是用吸管吸取一定體積的懸浮培養(yǎng)物轉入至新鮮培養(yǎng)基的一種方法。靜止法是將培養(yǎng)物搖勻，靜止片刻，待大塊的愈傷組織和細胞團下沉后，將上清部分轉至空的滅菌三角瓶，再靜止直至細胞團基本沉入瓶底，小心棄去1/2體積的上清，然后添加新鮮培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)的一種方法。瓶壁法是利用懸浮培養(yǎng)物在振蕩培養(yǎng)的過程中會產生附壁現象，即在三角瓶的周圍形成一個細胞圈，然后將這一部分細胞用勺子刮下轉入新鮮培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)的一種方法。 3.4 胡蘿卜愈傷分化

    將胡蘿卜懸浮細胞和愈傷組織分別轉入含不同激素及其組合的分化培養(yǎng)基中，25 ℃，光照培養(yǎng)。分化培養(yǎng)基分別為： ①B5（MS） 基本培養(yǎng)基（不添加激素）；②B5（MS）基本培養(yǎng)基+1.0mg/L BA；③B5（MS）基本培養(yǎng)基+1.0 mg/L BA +0.5 mg/L NAA。 3.5再生苗的生根及移栽

    將沒有生根的再生苗轉移至MS+0.2mg/L NAA生根培養(yǎng)基中生根壯苗。待根系發(fā)達移栽至蛭石：草炭土=3:1的基質中培養(yǎng)。

    4. 結果

    （1） 以胡蘿卜子葉、下胚軸和直根形成層均可誘導出愈傷組織，其中以下胚軸誘導出的胚性愈傷組織最適合細胞懸浮培養(yǎng)。

    （2） 誘導松散型愈傷組織最佳激素濃度配比為以MS或B5基本培養(yǎng)基加2，4-D 0.1mg/L較好，最適溫度為21℃~ 25℃， pH值為5. 8。

    （3） 在4次~5次繼代時，細胞系趨于穩(wěn)定。

    （4） 細胞起始密度在1. 125*104個/ 50mL~2. 325*104個/ 50mL時，7d~9d為對數生長期。

    （5） 懸浮細胞轉入MS固體培養(yǎng)基，7天長出新的愈傷組織，30天長出全株，并移植蛭石成活，目前已經長出胡蘿卜。

    5.胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)基 性能特點分析及討論

    5.1懸浮細胞系

    一個成功的懸浮細胞系一般來說具備以下3 個特征：一是懸浮培養(yǎng)物分散性良好， 細胞團較��；二是均一性好，細胞形狀和細胞大小大致相同，懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色彩呈鮮艷的乳白或淡黃色；三是細胞生長迅速。影響懸浮系建立的因素包括起始愈傷組織的質量，起始培養(yǎng)密度；培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件如培養(yǎng)溫度，繼代周期、繼代方式等。

    用于建立懸浮細胞系的愈傷組織要求分散性好，增殖快，再生能力強，一般來說其外觀呈乳白色或淡黃色，松散易碎。由外植體誘導來的愈傷組織往往有多種類型，選擇合適的愈傷組織類型或將已獲得的愈傷組織進行巧妙的繼代得到松散的胚性愈傷組織至關重要。該試驗中，胡蘿卜塊根愈傷組織的誘導受基本培養(yǎng)基影響不大，而激素對愈傷組織的狀態(tài)影響較大，以MS或B5基本培養(yǎng)基加2，4-D 0.1mg/L較好。

    5.2誘導激素

    在許多植物品種的再生過程中，在分化培養(yǎng)基中添加適量的BA和NAA對分化是非常有利的，但胡蘿卜愈傷組織的再生過程中BA和NAA的作用并不大，成苗非常慢，且再生頻率低，而不添加任何激素的MS和B5基本培養(yǎng)基上，愈傷組織分化率高，且大多通過胚狀體的方式成苗，這是因為胡蘿卜愈傷組織和懸浮細胞系具有較強的胚胎發(fā)生能力，在無激素的培

    養(yǎng)基上容易成熟和萌發(fā)成苗。從總體看，胡蘿卜愈傷組織出苗的時間相對較長，ABA可促進體細胞胚的成熟，在分化培養(yǎng)基中加入一定濃度的ABA是否可縮短胡蘿卜愈傷組織成苗的時間，

    5.3懸液起始密度

    在懸浮細胞培養(yǎng)體系中，接種初期細胞起始密度對細胞的生長非常重要，只有當起始細胞密度超過細胞生長的某一臨界密度時培養(yǎng)細胞才能生長，懸浮細胞的起始密度一般在（0.5～2.5）*10的5次方個/mL。 5.4懸浮培養(yǎng)物繼代的方法

    懸浮培養(yǎng)物繼代的方法有多種， 該試驗采取了吸取法、靜止法和瓶壁法等3 種繼代方式。

    吸取法通過吸取不同部分的培養(yǎng)物獲得不一樣的培養(yǎng)效果，吸取中間培養(yǎng)物繼代可獲得均一性好的單細胞或細胞團的懸浮細胞系，但增殖較慢，且在培養(yǎng)的初期不適宜使用此方法；吸取底部培養(yǎng)物繼代吸取的細胞團較大，懸浮細胞團生長較快，往往接種后2～3d就進入對數生長期，但容易產生較大的細胞團。

    靜止法相對于第2種吸取法來說，接種的懸浮細胞團小，生長速度也較快， 接種后第4～5天便進入生長期，細胞團數目明顯地多于吸取法的第1種方法，但懸浮培養(yǎng)物顆粒不如吸取法均勻。

    在植物細胞懸浮振蕩培養(yǎng)過程中，植物細胞也具有貼壁生長的現象。瓶壁法是利用植物細胞培養(yǎng)這一現象而出現的新的繼代方法，可獲得高頻率的、均一性好的單細胞懸浮細胞系。但采用此方法繼代發(fā)現，胡蘿卜懸浮振蕩培養(yǎng)中瓶壁上的細胞圈細胞分散性并不是很好，有一定的粘性，轉入新鮮培養(yǎng)基后通過振蕩培養(yǎng)很難使其分散開來，且繼代過程相對而言較為復雜，容易造成污染。因此，從總體效果看，胡蘿卜懸浮培養(yǎng)物的繼代可采用靜止法，當然，不同植物材料，不同實驗的要求可有針對性的選用。

    此試驗正在進行中。該試驗還發(fā)現，光照的強度和時間對胡蘿卜愈傷組織的分化影響非常大，光照時間過長，強度過大，愈傷組織容易變紫或褐化。 5.5無菌操作

    組培上常用的滅菌方法有物理和化學法。 常用的物理方法有：

    物理滅菌干熱、濕熱、射線處理、物理除菌、過濾、離心、沉淀等。 常用的化學方法：消毒劑、抗菌素滅菌。

    不同的物品要選用不同的滅菌方法。

    實驗室中常見儀器設備及其滅菌方法如下：

    （1）培養(yǎng)基滅菌：高溫高壓濕熱滅菌法。具體方法如下：壓力在9.8*104-10.8*104Pa，滅菌溫度在121℃，滅菌20-30min。

    （2）玻璃器皿滅菌：蒸汽高壓消毒滅菌、干熱消毒滅菌。 （3）塑料器皿滅菌：多采用高壓蒸汽消毒滅菌

    （4）金屬用具滅菌：灼燒滅菌。具體方法是：進入95%酒精，后置于酒精火焰上灼燒，冷卻后使用。

    （5）接種室殺菌：紫外線照射、空氣消毒滅菌。 超凈工作臺：紫外燈照射，70%-75%的酒精擦洗。 （6）外植物體滅菌：

    水沖洗10—20min或更長的時間→70%-75%酒精中浸泡30s→0.1%-0.2%液中浸泡10min左右→蒸餾水沖洗4-5次→備用。

    6.胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)基 注意事項：

    1、調節(jié)培養(yǎng)基時，理論上應調至5.8為宜，但因培養(yǎng)基經高溫高壓滅菌時，蔗糖分解，PH值會有所下降，因此調至6.0可減小誤差。

    2.防火。實驗中要經常用酒精消毒、用酒精燈燒鑷子、刀具，注意安全。 3.無菌操作。材料經HgCl2消毒后，即認為是消毒干凈，此后的操作中的用具要求無菌。為防止染菌，注意：手要用酒精擦干凈；鑷子和刀經常在火焰上燒；錐形瓶、手不要放在盛材料的培養(yǎng)皿上方。

    4.廢液處理。酒精要回收，放原處；HgCl2有劇毒，小心不要濺出，廢液使用后應按要求放到位置。

    5.實驗材料大小應適中，不宜太大或太小。 6.實驗中接種過程要在操凈工作臺進行，接種前，實驗所用的所有器械及手均需嚴格消毒滅菌。

    7.切胡蘿卜時，下面應墊上濾紙。 8.接種時，動作要輕，力度適中。不要把接種的切塊壓入培養(yǎng)基里面，以致破壞培養(yǎng)基。 9.接種時瓶口應傾斜45度，以免手、鑷子上的贓物容易掉到三角瓶里。

    10.操作期間應經常用70%—75%的酒精擦拭工作臺和雙手；接種器械應反復在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。

    11.滅菌鍋有很多種，實驗室中常用手提式高壓蒸汽滅菌鍋，使用時要注意以下幾點：

    （1）鍋中應放足量的水，以免造成空燒或干燒；

    （2）裝鍋時不要過度傾斜，可保持內部有一定的空間，利于蒸汽流動；

    （3）增壓前高壓鍋內的空氣必須排凈，否則易影響滅菌效果；

    （4）滅菌過程中，應盡量保持壓力恒定，嚴格遵守滅菌時間；

    （5）排氣降壓時應緩慢進行；

    （6）只有待高壓鍋內壓力表指針恢復到零后，才能開啟壓力鍋； （7）高壓鍋工作時，應有專人看守。 12.培養(yǎng)基的保存應注意以下幾點：

    （1）滅菌后的培養(yǎng)基經冷卻和凝固后即可使用檢驗滅菌效果。

    檢驗是否無菌的方法： 將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)室中3天，若沒有污染現象，說明滅菌可靠，可以使用。

    （2）保存在低溫條件下。常溫下保存時要進行防塵和避光處理。 （3）保存時間不可過長。

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